Clonamiento, expresión y caracterización de las subisoformas de la Proteínasa CK1 αReportar como inadecuado




Clonamiento, expresión y caracterización de las subisoformas de la Proteínasa CK1 α - Descarga este documento en PDF. Documentación en PDF para descargar gratis. Disponible también para leer online.

Profesor guía

Allende Rivera, Jorge; - Resumen

La proteínaquinasa CK1 es una enzima altamente ubícua y conservada en todos los eucariontesestudiados y, particularmente, dentro de los vertebrados. En estos organismos, la enzima existecomo una familia de siete miembros genéticamente distintos, denominados CK1#, #, #1, #2, #3,# y #. Hasta el momento se ha determinado que los mensajeros de tres de estas isoformas, #, #1 y#3, sufren procesamiento alternativo, dando lugar así a nuevas variantes. En particular, el mRNAde la isoforma a da origen a 4 subisoformas, definidas por la presencia o ausencia de 2segmentos adicionales, llamados inserto L e inserto S. El primero se ubica en medio del dominiocatalítico de la enzima, en la llamada region -bisagra- y el segundo se encuentra localizado en elextremo C-terminal. La coexistencia de algunas o todas estas variantes se ha descritoanteriormente en rata, pollo y humano y las secuencias de los insertos se encuentran altamenteconservadas entre estas especies.En esta Tesis, se clonaron las cuatro variantes de procesamiento de CK1# de pez cebraDanio rerio y se expresaron tanto en células deE. colicomo en células eucarióticas en cultivo.La caracterización bioquímica de las variantes recombinantes expresadas en bacteriasdeterminaron que las que contienen el inserto L tienen una menor afinidad por ATP, al igual quepor el inhibidor específico, CKI-7, que compite por el sitio de unión del nucleótido. Estasvariantes, además, muestran una mayor actividad hacia #-caseína, aunque no existen diferenciasen el valor de la Km aparente entre las cuatro isoformas con respecto a los sustratos proteicos ypeptídicos ensayados, #-caseína, fosvitina y el péptido RRKDLHDDEEDEAMSITA, derivadodel inhibidor-2 de la proteína fosfatasa 1 PPI2. Las variantes L también exhiben una mayortermolabilidad a 40°C, comparadas con las que no contienen este inserto. Esta secuenciacontiene además un sitio canónico para la fosforilación por PKA y, al ser incubadas con estaenzima, la fosforilación es estimulada en 2 veces para CK1#, 6 veces para #S, 16 veces para #L yaproximadamente 70 veces para #LS. Esto sugiere que la PKA fosforila a CK1#, en particulardentro de los insertos y especialmente el inserto L. Por otro lado, las cuatro variantes poseíanactividad autofosforilativa y tirosinaquinasa.Otro aspecto abordado en esta Tesis fue la fosforilación de NFAT4 por CK1. El trabajo deZhu y col. 1998 demuestra que este factor de transcripción es fosforiladoin vivopor CK1# yque esta fosforilación previene la entrada de NFAT4 al núcleo. En esta publicación se describeun putativo sitio de acoplamiento o -docking- dentro de la secuencia donde interactúa CK1. Ennuestro estudio se utilizaron péptidos sintéticos que abarcaban las regiones conservadas A y Z yla región -linker- entre ellas L. Tanto las variantes de CK1a de pez cebra como CK1 nativapurificada de hígado de rata fosforilaban residuos no canónicos contenidos en la región A2, perono la Z, a diferencia de lo encontrado por Zhu y col. 1998. Una extensión de residuos acídicospresentes en la región L demostró ser esencial para la fosforilación eficiente del dominio A2,como se pudo determinar por un aumento en la Km de un orden de magnitud provocada por ladeleción de la región L o por la sustitución de los residuos acídicos por glicinas o alaninas. Esteresultado también difiere de los de Zhu y col., que habían ubicado el sitio -docking- en la regiónA2. Por otro lado, al reemplazar una de las serinas del extremo N-terminal de la región A2, laSer177, por fosfoserina, se desencadena un efecto jerárquico que provoca un aumento dramáticoen la eficiencia de fosforilación del péptido. Estos datos son consistentes con un mecanismobifásico de fosforilación, en que la región L provee un sitio -docking- funcional que facilita lafosforilación no canónica de la Ser177, la que, consiguientemente, gatilla una cadena defosforilaciones jerárquicas río debajo de este residuo.Con objeto de realizar estudios sobre el comportamientoin vivode las variantes de CK1#, setransfectaroncélulasCos-7conconstruccionesdeCK1#yCK1#L.Medianteinmunocitoquímica, se determinó que la CK1# se localizaba en forma generalizada dentro de lacélula, predominantemente en el citoplasma. CK1#L, en contraste, se localizaba en formapredominante en el núcleo, lo que sugiere que la secuencia PVGKRKR, contenida dentro delinserto L, constituiría una señal de localización nuclear funcional. La variante más larga tambiénexhibió una vida media 4 veces menor que CK1#, siendo de 97 y 400 minutos, respectivamente,como fue determinado por experimentos de pulso y caza en células transfectadas y marcadasmetabólicamente con35S.Mediante experimentos de RT-PCR utilizando RNA total de embriones y adultos de pezcebra, se determinó que la proporción relativa de los transcritos de las cuatro subisoformas varíaa lo largo del desarrollo y en adulto, observándose un aumento relativo de #S y una caída en elnivel de #L entre los estadíos de 1 célula y larva 4-5 días. Además, por hibridación in situutilizando una sonda general para las cuatro variantes de CK1#, se observó una expresióngeneralizada de los mensajeros de esta isoforma de CK1 hasta las 24 h de desarrollo y, entre los2 y 3 días, una localización más específica en la cabeza y el primordio de la aleta pectoral.En síntesis, la presencia del inserto L confiere a la enzima algunas propiedades que ladistinguen de las variantes que no contienen este inserto: Altera el sitio de unión a ATP,disminuyendo levemente la afinidad por el nucleótido, disminuye la estabilidad de la enzima,tantoin vivocomoin vitrofrente a una temperatura de 40°C, aumenta el nivel de fosforilación dela CK1# en presencia de PKA y concentra la enzima en el núcleo, probablemente debido a lasecuencia PVGKRKR contenida en el inserto L.Nota general

Doctor en Ciencias con Mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias



Autor: Burzio Menéndez, Verónica; -

Fuente: http://repositorio.uchile.cl/



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