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1 CBM - Centre de biophysique moléculaire

Abstract : Gene therapy aims to cure genetic deficiencies and a large variety of acquired diseases by the introduction of nucleic acids into mammalian cells. As an alternative to viral gene delivery vectors, chemical vectors have been developed with reduced immunogenicity, in addition to low cost and ease of production. So far, cationic liposomes and cationic polymers are the most studied and used chemical vectors to transfer therapeutic plasmid DNA pDNA. Among multiple biological barriers, the limited cytosolic diffusion of pDNA is critical for level of transgene expression. The goal of this work was to identify a dynein-binding peptide which would facilitate the transport of pDNA to the nucleus along microtubules. To this end, we have investigated interaction network of adenoviral protein E3 14.7K. E314.7K is indirectly interacting with Dynein Light Chain TCTEL1 through FIP-1. Different techniques have been used to analyze the protein interactions such as Bioluminescence Resonance Energy Transfer BRET, Förster Resonance Energy Transfer FRET, Fluorescence Lifetime Imaging FLIM, immunoprecipitation and Laser Scanning Confocal Microscopy LSCM. BRET technique allow us to identify a 20 amino acids peptide of E3 14.7K P79-98 responsible for its interaction with FIP-1. Associated with Quantum Dots P79-98 P79-98-Qdot gave colocalizations with isolated microtubules and microtubules in HeLa cells. We have developed the grafting of the peptide directly on the pDNA. Once grafted with P79-98 pDNA is able to interact with microtubules in HeLa cells and traffick along them toward nucleus. Remarkably transfection efficiency of polyplexes is increased up to 77% in HeLa cells.

Résumé : L’objectif de la thérapie génique est de guérir des déficiences génétiques et de nombreuses maladies acquises par l-introduction d-acides nucléiques dans les cellules mammifères. Les vecteurs chimiques sont une alternative aux vecteurs viraux pour le transfert de gène, leur immunogénicité est réduite, en plus de leur faible coût et de la facilité de leur production. Jusqu-à présent, les liposomes et les polymères cationiques sont les vecteurs chimiques les plus étudiés et utilisés pour le transfert d-ADN plasmidique ADNp thérapeutique. Parmi les multiples barrières biologiques, la diffusion cytosolique limitée de l’ADNp est critique pour le niveau d-expression du transgène. Le but de ce travail de thèse était d-identifier un peptide de liaison à la dynéine, qui serait capable de recruter la protéine motrice dynéine et de faciliter le transport d’ADNp vers le noyau le long des microtubules. Nous avons donc étudié le réseau d-interaction de la protéine adénovirale E3-14.7K. E3-14.7K est indirectement en interaction avec la chaîne légère de la dynéine TCTEL1 par l’intermédiaire de FIP-1. Différentes techniques ont été utilisées pour analyser les interactions de ces différentes protéines telles que Bioluminescence Resonance Energy Transfer BRET, Förster Resonance Energy Transfer FRET, Fluorescence Lifetime Imaging FLIM, immunoprécipitation et Laser Scanning Confocal Microscopy LSCM. La technique de BRET nous a permis d-identifier un peptide de 20 acides aminés d-E3-14.7K P79-98 responsable de son interaction avec FIP-1. Associé à des Quantum Dots P79-98 P79-98-Qdot colocalise avec les microtubules isolés et dans les cellules HeLa. Nous avons mis au point une méthode de greffage du peptide directement sur l’ADNp. Une fois greffé avec P79-98 l’ADNp est capable d-interagir avec les microtubules dans les cellules HeLa et de migrer activement jusqu’au noyau. P79-98 améliore l-efficacité de la transfection des HeLa jusqu’à 77%.

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Keywords : Dynein Gene therapy Traffic

Mots-clés : Thérapie génique Trafic Microtubule Dynéine E3-14.7K





Autor: Lucie Pigeon -

Fuente: https://hal.archives-ouvertes.fr/



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