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1 CNPS - Centre de Neurosciences Paris-Sud 2 Centre de Neurosciences Paris-Sud Orsay, Essonne

Abstract : Type 2 diabetes and cancer represent the major public health problems. One important therapeutic target for these pathologies is the protein tyrosin phosphatase PTP1B. The phosphatase is known to negatively regulates the insulin signaling pathway by dephosphorylating the insulin receptor, IR or the insulin receptor substrate, IRS. However,PTP1B functions and its regulation mechanism remain poorly known. Two studies has notably described opposite effects of PTP1B activity following phosphorylation of its Ser50 residue either by CLK1-CLK2, LAMMER kinases or by AKT. Furthermore, AKT, a main insulin signaling pathway component, has been shown to phosphorylate the LAMMER kinaseCLK1 following insulin stimulation. In addition, the role of PTP1B in the regulation of the RAS-MAPK signaling pathway and hence in cancer is a very controversial subject. The first objective of this work was to analyse, the role of Ptp61F the Drosophila ortholog of human PTP1B in the Drosophila insulin pathway, the interaction between the phosphatase and the Drosophila LAMMER kinase gene, Doa, the role of Ptp61F in the RAS-MAPK signaling pathway. To achieve these, we took advantage of the genetic powerful of Drosophila to generate a Ptp61F gene mutant which has been characterized and its role in signaling pathways has been studied. This study showed that Ptp61F interacts with IR like PTP1B in mammals. It shows that Ptp61F regulates key components of insulin signaling pathway Pi3K-Akt. It also shows that Ptp61F is able to regulate the Drosophila LAMMER kinase gene, Doa. Finally, we noted that Ptp61F interacts by inhibiting the activity of severalcomponent of the RAS-MAPK signaling pathway of Drosophila Egfr, Ras, rl human ERK and conclude that Rl coud be a direct substrate of PTP61F. The data showing that Ptp61F interacts with Akt and the Drosophila LAMMER kinase gene, Doa, were the basis for the second study in order to show the role that the mammal LAMMER kinase CLK2 Cdc-like kinase 2 could play in the insulin signaling pathway at molecular level using the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. From this second study, we show that CLK2 play an important role in insulin signaling. CLK2 is induced by insulin and its expression increases with time. PTP1B interacts in vivo and in vitro with CLK2. Overexpression of CLK2 impairs AKT phosphorylation by a mechanism which could involved PTP1B, since in vitro, CLK2 phosphorylates PTP1B and the latter interacts withAKT in vivo. It is the Ser50 residue of PTP1B being phosphorylated by CLK2 and this phosphorylation event represses PTP1B activity in vitro. AKT cannot phosphorylates PTP1B in vitro, suggesting that the phosphorylation of PTP1B by AKT could be cellular environment dependant.

Résumé : Le diabète de type 2 et le cancer représentent des problèmes majeurs de santé publique. Une cible thérapeutique importante de ces affections est la protéine tyrosine phosphatase PTP1B. Cette dernière est connue pour réguler la voie de l’insuline en déphosphorylant le récepteur de l’insuline, IR ou le substrat du récepteur de l’insuline, IRS. Cependant lesfonctions de PTP1B, le mécanisme par lequel cette phosphatase est régulée restent très ou pas connus. Deux études ont notamment décrites des effets opposés de l’activité de PTP1B suite à la phosphorylation sur résidu de Ser50 de PTP1B par CLK1-CLK2, des kinases LAMMER d’une part et AKT d’autre part. AKT a aussi été montré de phosphoryler la kinase LAMMER CLK1. Par ailleurs, le rôle de PTP1B dans la régulation de la voie Ras-MAPK et donc dans le cancer est un sujet très controversé. L’objectif premier de ce travail de thèse a été d’analyser, le rôle de Ptp61F l’orthologue de Drosophile de PTP1B dans la voie de l’insuline de Drosophile, l’interaction entre la phosphatase et la kinase LAMMER de Drosophile, DOA, le rôle de cette phosphatase dans la voie RAS-MAPK. Pour se faire, nous avons utilisé la puissance génétique de laDrosophile pour générer un mutant du gène Ptp61F qui a été caractérisé et son rôle dans les voies de signalisation a été étudié. Cette étude a montrée que, Ptp61F interagit avec IR comme PTP1B chez les mammifères. Elle montre que Ptp61F régule les acteurs clés de la voie de l’insuline Pi3K-Akt. Elle a également montrée que Ptp61F pouvait réguler les fonctions du gène de la kinase LAMMER de Drosphile, Doa. Elle montre enfin que Ptp61F interagit avec nombreuses composantes de la voie RASMAPK de Drosophile Egfr, Ras, rl ERK humain en réprimant la fonction de chacun de ces gènes et que Rl serait un substrat direct de PTP61F. Les informations selon lesquelles, Ptp61F interagit avec Akt et le gène de la kinaseLAMMER de Drosophile, Doa ont été utilisées dans la deuxième étude pour montrer le rôle que les kinases LAMMER notamment CLK2, Cdc-like kinase 2 pouvaient jouer dans la voie de signalisation de l’insuline au niveau moléculaire en utilisant les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y. Il en ressort que la kinase CLK2 joue un rôle importantdans cette voie de signalisation. CLK2 est induit par l’insuline et son expression augmente avec le temps. PTP1B interagit in vitro et in vivo avec CLK2. La surexpression de CLK2 induit la baisse de la phosphorylation de AKT par un mécanisme qui pourrait passer par PTP1B, puisque in vitro, CLK2 phosphoryle PTP1B et ce dernier interagit avec AKT in vivo. C’est le résidu de Ser50 de PTP1B qui est phosphorylé et cette phoshphorylation réprime l’activité de PTP1B in vitro. On n’observe cependant pas AKT capable de phosphoryler PTP1B in vitro suggérant que la phosphorylation de PTP1B par AKT serait dépendante du contexte cellulaire.

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Keywords : LAMMER kinases CLK2 Type 2 diabetes

Mots-clés : Diabète de type 2 Cancer Kinases LAMMER CLK2 PTP1B-PTP61F AKT Ser50





Autor: Stéphane Tchankouo Nguetcheu -

Fuente: https://hal.archives-ouvertes.fr/



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