en fr Disrupted nuclear localization and function of the human mutant R482X of the calcium channel Cavb4 subunit Les déterminants moléculaires et cellulaires de la mutation humaine R482X de la sous-unité Cavb4 impliqués dans Reportar como inadecuado




en fr Disrupted nuclear localization and function of the human mutant R482X of the calcium channel Cavb4 subunit Les déterminants moléculaires et cellulaires de la mutation humaine R482X de la sous-unité Cavb4 impliqués dans - Descarga este documento en PDF. Documentación en PDF para descargar gratis. Disponible también para leer online.

1 GIN - Grenoble Institut des Neurosciences

Abstract : High voltage-activated HVA calcium channels are hetero-multimeric complexesthat translate electrical signals into Ca2+ influx, a secondary messenger that mediatesessential neuronal processes such as neurotransmitter release and neuronal excitability.HVA calcium channels are composed of four subunits: Cavα1 subunit, the pore formingof the channel and the auxiliary subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. The Cavß subunit hasfocused much of the interest owing to its regulatory functions within the complex. Bymasking an endoplasmic retention signal on the Cavα1 subunit, Cavß subunit targets themature calcium channel to the plasma membrane and contributes to the increase innumber of functional calcium currents. In humans, pathologic mutations have beenidentified in CACNAB4 that produce epileptic phenotype. One of these mutations is apremature termination mutation R482X. Mutations produced minor biophysical effectson calcium channels in spite of their preponderant pathological phenotypes, which tend toindicate that cellular functions other than channel regulation may be responsible for thepredominant neurological effects of the R482X mutation.My thesis focuses on the molecular and cellular determinants of the Cavb4 mutantR482X inducing the human neurological phenotype. Studies were realized inhippocampal neurons which are particularly implicated in epilepsy. A translocation ofendogenous Cavß4, from the cytoplasm to the nucleus is observed during neuronaldifferentiation and synaptogenesis. This translocation is conditioned by the nativestructural conformation of Cavß4 subunit; carboxy-terminal deletion inhibits the nuclearlocalization of the mutant. The 38 amino acids deletion disturbs the structure of Cavß4 byaltering the intramolecular interaction between the two conserved domains in Cavß4subunit. In hippocampal neurons, this structural distortion prevents the nuclearlocalization of the mutant Cavß4. In order to identify the impact of the nuclear localizationof the Cavß4 subunit on transcriptional regulation, a study on gene expression generatedby microarray is realized. Profiles of gene expression revealed a differential generegulation between wild-type and mutant Cavß4. Cavß4 subunit seems to have a repressiveaction on gene regulation; on the other hand, the lack of nuclear localization of themutant reverses this repressive impact. Among the specific transcripts differentiallyexpressed, some genes are primordial keys in neuronal activities, thus alterations in theregulation of these genes could be involved in neuronal diseases. Since no NLSconsensus sequence has been identified on Cavß4, two-hybrid assay was realized in orderto identify partners responsible of the Cavß4 nuclear targeting. A specific protein holdinga NLS sequence interacts specifically with Cavß4 subunit, but not with the mutant, and isable to target Cavß4 to the nucleus. The other protein which specifically interacts with theWT Cavß4 sequesters Cavß4 in the cytoplasm.Finally, the lack in nuclear targeting of the R482X mutant due to the structuraldistortion appears to alter the transcriptional gene regulation which is maybe implicatedin the epileptic phenotype of patients holding the mutation.

Résumé : Les canaux calciques neuronaux activés par la dépolarisation membranairecontrôlent diverses fonctions cellulaires telles que l-excitabilité neuronale et latransmission synaptique. Les canaux calciques sont formés d-une sous-unité principaleCav associée à 3 sous-unités régulatrices b, a2d et g. La sous-unité auxiliaire Cavb joueun rôle crucial dans la régulation des propriétés biophysiques du canal et dans l-adressagemembranaire de la sous-unité Cav. Chez l-homme, un isoforme de cette sous-unité Cavb4est l-objet de mutations qui conduisent à des phénotypes épileptiques. L-une de cesmutations est une délétion d-une partie du domaine carboxy-terminal de Cavb4 R482X.Les efforts effectués pour comprendre les mécanismes cellulaires du phénotypeépileptique des patients concernés n-ont pas encore aboutit à des explications probantes.Ainsi, le phénotype neurologique ne semble pas lié à une altération de l-activité du canal,mais plus vraisemblablement à des fonctions cellulaires inconnues de Cavb4.Ma thèse porte sur la caractérisation des déterminants moléculaires et cellulairesdu mutant humain R482X impliqué dans le phénotype neurologique des patients quiportent la mutation. Etant donné que l-épilepsie implique essentiellement les neurones dulobe temporal, je me suis particulièrement intéressée à l-étude des fonctions et de lalocalisation de Cavb4 dans les neurones d-hippocampe. Dans ces cellules, unetranslocation de la sous-unité Cavb4 du cytoplasme vers le noyau est notée au cours de ladifférenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l-intégrité structurale dela sous-unité Cavb4, elle est perdue dans le cas de la mutation R482X. La perte dufragment carboxy-terminal conduit à une altération de la structure de Cavb4 suite à larupture de l-interaction intramoléculaire entre les deux domaines conservés, au sein de laprotéine native. Dans les neurones d-hippocampe, cette déstructuration empêche lalocalisation nucléaire de la protéine mutante. Etant donné que la sous-unité Cavb4 nepossède aucun signal d-adressage nucléaire, la technique du double hybride a été réaliséeafin de déterminer les partenaires protéiques capables d-adresser la sous-unité Cavb4 versle noyau. Parmi les trois protéines criblées qui interagissent spécifiquement avec Cavb4 etpas avec le mutant, une est capable d-adresser Cavb4 dans le noyau alors que l-autre laretient dans le cytoplasme. Afin d-étudier l-effet de la localisation nucléaire de la sousunitéCavb4 sur la régulation génique, une étude transcriptomique a été réalisée. La sousunitéCavb4 montre un effet répressif sur l-expression génique. Cette répression estinversée dans le cas du mutant incapable de s-adresser vers le noyau des neurones. Parmices gènes, plusieurs sont des candidats potentiels pour expliquer l-altération d-activitésneuronaux impliquée dans le phénotype épileptique.Enfin, l-absence de l-adressage nucléaire de la sous-unité Cavb4 mutante R482Xdue à la déformation de sa structure native, altèrerait la régulation transcriptionnelle desgènes, qui serait à la base du phénotype épileptique des patients qui portent cettemutation.

Mots-clés : double hybride sous-unité Cavb des canaux calciques voltage dépendants hippocampe épilepsie juvénile myoclonique mutation double hybride.





Autor: Abir Tadmouri -

Fuente: https://hal.archives-ouvertes.fr/



DESCARGAR PDF




Documentos relacionados